氨基酸衍生物的测定实验

来源：www.bio-sensor1.org 发布时间：2014-11-27

邻苯二甲醛（OPA）衍生法由JoneBN等早提出，具有衍生步骤简单、反应速度快、剩余试剂不干扰测定的特点，在柱前衍生试剂中应用为广泛。
　　在还原剂β-巯基乙醇的作用下，OPA与一级氨基酸迅速反应生成1-硫代-2-烷基异吲哚，衍生反应可在13min内完成。衍生物经RP-HPLC分离后即可进行荧光检测，灵敏度可达fmol的水平。由于β-巯基乙醇作还原剂时天冬氨酸/丝氨酸、缬氨酸/甲硫氨酸衍生物的色谱分辨率较差，现多用3-巯基丙酸（3-MPA）代替，通过引入一个α-羧基，使上述两对氨基酸衍生物的疏水性相对减弱，再用乙腈替代甲醇作为流动相，同时优化梯度程序使其得到完全分离。

该柱前衍生化试剂本身仍存在一些不足。

，OPA试剂本身容易被空气中的氧气氧化而降解(由无色透明变成微黄色)，试剂保存困难。将OPA与β-巯基乙醇结合作为衍生化试剂可部分解决该问题，上述试剂在40℃黑暗条件下可稳定存放1周。

第二，OPA与氨基酸的衍生产物也不稳定，衍生后需立即进样分析。为解决此问题，在实际操作中采取的方法是加入硼酸盐缓冲液和减少并固定从衍生化操作到完成手工进样的时间。
　　PITC可与一、二级氨基酸反应生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC）。该反应只需在室温下进行20min，然后经两步快速蒸发即可完成[21]该反应的衍生物单一、稳定，经RP-HPLC分离后，用紫外检测器在254nm处检测，小检出量大约为1pmol。目前此方法已拓展应用到含磷氨基酸和含硫氨基酸等修饰氨基酸的分析过程。但该方法也存在以下缺点：氨基酸衍生时需真空干燥以除去过量的衍生试剂，使得PITC法很难实现操作全部自动化；PITC毒性大，且需专门的衍生装置在无水状态下进行；PITC会降低分析柱的使用寿命，普通的C18色谱柱的耐用性较差，使用一段时间后分离效果迅速下降，通过调整流动相梯度很难改善。

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